Från Hedera till helix – att trolla DNA ur blad

Föredrag av Johan Rova den 28 september 2000

Föredraget behandlade i åskådlig form hur man tar fram DNA ur växtmaterial samt hur man går tillväga för att bestämma i vilken ordning “bokstäverna” A, C, G och T förekommer i den DNA-bit man studerar. Johan började med att beklaga att han, trots titeln, inte skulle använda murgröna, men hoppades att auditoriet skulle vara lika nöjda med smörgåskrasse (kryddkrassing, Lepidium sativum). När man skall extrahera DNA går färska växter utmärkt, men även pressat herbariematerial går i regel bra (även äldre dito), förutsatt bara att det inte behandlats med sprit, formalin eller andra konserveringsmedel eller torkats över allt för hög värme. Sagt och gjort, Johan mosade ned krassen i en mortel och tillsatte diskmedel och vatten så att han efter en stunds arbete kunde framvisa en “klorofylldrink”, rätt lik spenatsoppa.

Medan soppan fick stå och dra berättade Johan om hur han i sin systematiska forskning hade utnyttjat DNA för att konstruera hypotetiska släktträd för de delar av kaffefamiljen Rubiaceae som han studerat. Rubiaceae omfattar ca 12000 arter, allt från koralltuva Nertera granadensis till stora träd i Amazonas, så här hade han ju trots allt haft en hel del morfologiska karaktärer att titta på, men inom t.ex. svampsystematiken har DNA visat sig ge mycket nya upplysningar när “allt ser likadant ut”. Fördelarna med DNA-undersökningar är alltså ofta uppenbara, men även nackdelar finns, framför allt är det dyrt, både maskiner och kemikalier kostar stora pengar och en del av de sistnämnda är också mycket farliga, ofta carcinogena.

DNA uppbyggs av en dubbel spiral, en s.k. helix, där “bokstäverna” (nukleotiderna) A, C, G och T bildar “stegpinnar”. När den levande cellen efter “ritningarna” i DNA bildar proteiner tolkas DNA i grupper om tre och tre “bokstäver”, men när man sekvenserar DNA för systematiska ändamål är man bara intresserad av att jämföra “bokstävernas” ordning i en viss liten bit av DNA hos ett antal olika arter. I en växtcell finns det DNA på tre olika ställen: i cellkärnan, i mitokondrierna och i kloroplasterna. Johan hade studerat kloroplast-DNA. Man kan inte i förväg veta vilken liten del av DNA:t som kan vara lämplig för studier, eftersom mutationer sker olika ofta i olika delar av genomet, så man får pröva sig fram till var de har skett “lagom fort” eller hämta idéer från andra forskares publicerade resultat.

Åter till “soppan”: Johan hällde den genom ett kaffefilter för att få bort återstående växtdelar, varefter en klar, grön vätska återstod. Därefter tillsatte han sprit, vilket får DNA att “krulla ihop sig” och sjunka till botten. Denna process tar dock en hel vecka, men så länge hade vi ju inte tid att vänta. Johan erbjöd strax en lösning på detta: genom att centrifugera vätskan snabbar vi på sedimentationen. Tvättstugans centrifug är dock väl långsam för detta, så Johan hade lånat en bättre från Systematisk botanik. Han fyllde två rör med den gröna vätskan, placerade dem i maskinen och satte igång den. Efter någon minuts surrande var det över och rören togs ut. Jaha, det hade ju faktiskt blivit en fällning i botten på rören, vilka fick gå runt bland publiken. Denna fällning består till stor del av DNA, men även en del annat ingår.

Om man vill göra om detta själv hemma i köket rekommenderade Johan djurceller, lämpligt är färsk sillmjölke. Recept: blanda 1 dl sillmjölke (mycket färsk), 1 dl vatten och några droppar diskmedel i morteln och riv runt med mortelstöten tills blandningen är homogen. Tillsätt 1-2 msk koksalt och blanda om. Fyll därefter försiktigt på T-röd till ungefär dubbla volymen. Vattnet och spriten kommer nu att bilda två olika faser, varvid DNA:t vandrar upp i den övre (spriten), där det kan iakttagas som en trådig substans.

När man nu fått fram DNA, vilken del skall man då egentligen titta på? Gener anses mutera “långsamt”, mera intressant ur systematikerns perspektiv är icke kodande DNA, s.k. “skräp-DNA”, som kanske kan mutera “vilt”. Den del man nu vill ha måste kopieras upp och för detta används en “kopieringsmaskin”, som utnyttjar den s.k. PCR-processen, som belönats med Nobelpriset i kemi 1993.

PCR (Polymerase Chain Reaction) är en metod som efterliknar det som sker vid celldelningen. Ett glasrör får motsvara cellväggen och i detta fyller vi på vatten, salter, nukleotider (“lösa bokstäver”) och vårt DNA, som utgörs av en dubbel spiral med “bokstäver”, där basparningen är en mycket viktig egenskap: A hör alltid ihop med T och C på motsvarande sätt med G. Vi häller även i “primers”, korta DNA-bitar som kan tänkas passa ihop med ena ändan på det område vi vill studera: GATC passar t.ex. bra ihop med CTAG, GCCT med CGGA. Vi måste också tillsätta ett kopieringsenzym, en “arbetare” som plockar in “bokstäverna” på rätt ställen och för detta ändamål används Taq. Detta enzym är själva kärnan i PCR-processen. Alla levande organismer har enzym som kopierar DNA, s.k. DNA-poymeraser, men dessa kan bara fungera vid rätt temperaturer. Människans fungerar utmärkt vid 37°C, men havererar ohjälpligt om temperaturen går över 50°C. Emellertid finns det bakterier som lever i heta källor och ur en av dem (Thermus aquaticus) har Taq tagits fram; vi har alltså ett enzym som nästan tål att kokas utan att koagulera. Det fungerar dock bäst vid 72°C.

Kopieringen sker i flera omgångar (cykler). Steg 1 innebär att vi hettar upp blandningen till 94°C under en halv minut, vilket medför att DNA-trådarna i spiralerna lossnar från varandra (Johan klipper isär bokstavsföljderna under OH-apparaten). I steg 2 kyler vi ned till 60°C under knappt en minut, varvid våra “primers” fastnar på lämpliga ställen utmed de fria DNA-trådarna (Johan skriver en “primer” utmed bokstavsföljden). Steg 3 innebär slutligen att vi värmer ytterligare till 72°C under en stund, så att Taq sätter igång med att bygga på de korta “primers” till längre DNA-bitar (Johan skriver bokstäver utmed de gamla följderna). Hur lång tid vi håller oss vid denna temperatur avgör hur långa stycken vi får, ofta kan en minut vara lagom, då Taq bygger in ca 1000 “bokstäver” i minuten.

Därefter återgår vi till steg 1 och lossar så de nybildade DNA-trådarna från varandra (Johan klipper isär dem också) och upprepar så hela processen gång på gång. För varje cykel fördubblas antalet DNA-stycken av det slag vi önskar och efter ungefär trettio cykler brukar det vara färdigt. “Primers” och “bokstäver” förbrukas givetvis under processen, så man måsta ha i mycket från början. En lämplig längd för en “primer” är 25 “bokstäver”; sådana går att beställa från företag som tillverkar dem med den sekvens man önskar. Man skulle också kunna tänka sig att tillsätta andra enzym som skiljer DNA-trådarna åt, men temperaturen är klart lättare att ändra på och man behöver inte bekymra sig om hur man skall få bort eller deaktivera en tidigare aktiv substans. Ibland kan det bli problem, t.ex. om det hos någon av de växter som man tittar på har inträffat en mutation just i det område där vi vill att “primern” skall fästa, då får vi ingen PCR-produkt.

Nu har vi massor av DNA-trådar med just det utseende som vi var intresserade av, men hur skall vi avgöra hur de egentligen ser ut? Jo, vi kör ytterligare en PCR-process, men med något annorlunda förutsättningar. Förutom allt som vi förra gången blandade i röret tillsätter vi även “specialbokstäver” som har två avvikande egenskaper: dels har de en “knuten näve” så att de sätter stopp för vidare påbyggnad av den DNA-tråd där de byggts in, dels svarar de på laserbelysning med fluorescens i en viss färg som talar om vilken “bokstav” det rör sig om. Efter många PCR-cykler får vi så oliklånga DNA-trådar av alla längder från “primerns” plus ett upp till lika långa som vårt DNA-fragment, alla slutande på en “specialbokstav”.

För att separera dessa oliklånga DNA-trådar använder vi oss av elektrofores. Detta innebär att DNA-trådarna får “åla sig fram” genom ett gelé av polyakrylamid under påverkan av en elektrisk spänning. Vid änden av gelén går en laserstråle och mittemot denna sitter en sensor som tar emot eventuellt fluorescensljus. De korta DNA-trådarna rör sig betydligt snabbare genom geléns nätliknande struktur än de längre, varför den allra kortaste kommer fram först och ger en signal, låt oss säga blått, alltså C. Därnäst kommer den näst kortaste dit och lämnar sin signal o.s.v. Allt detta sker inuti en stor (och dyr) maskin kopplad till en dator som håller reda på i vilken ordning de olika färgerna (=”bokstäverna”) ålat sig fram genom gelén. På så sätt får vi reda på vilken DNA-sekvens vi hade i vårt ursprungliga fragment.

Vid den efterföljande frågestunden framkom bl.a. att bara hälften av den under första omgången bildade PCR-produkten utnyttjas vid läsningen, men den andra hälften används som kontroll. Hos några få arter som människa, backtrav, bananfluga, jäst och kolibakterie har man sekvenserat hela genomet, men hos andra arter har man bara sekvenserat små utvalda delar. RUBISCO-genen har sekvenserats hos flera tusen växtarter, däribland någon art ur de flesta växtfamiljer. S.k. “skräp-DNA” behöver inte vara betydelselöst, det kan bl.a. vara nödvändigt för DNA-molekylens tredimensionella form. Oftast vet man inte vad som är en gen och vad som inte är det, dessutom kan åtminstone hos bakterier vissa gener vara “överlappande”, så att samma sekvens kan läsas med ett (eller två) baspars förskjutning och ge upphov till helt olika proteiner.


Detta är ett referat nedtecknat av föreningens sekreterare och kontrollerat av föredragshållaren. Den som trots det vill kommentera eventuella brister i innehållet bedes i första hand kontakta Botaniska Föreningen i Göteborg .

Tillbaka till andra föredrag


Botaniska föreningen i Göteborg